增加PCR的特異性
1. primers design
   這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a  足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b  GC% 40%~~~~60%
c  5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d  避免3'端GC rich, 最后3個(gè)BASE不要有GC,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是GC
   e. 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER
   f. 避免3'端的錯(cuò)配
   g. 避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
   h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時(shí)不需要加上這些序列,但在檢測(cè)互補(bǔ) 和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們
   i. 需要使用兼并引物時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
   j. 最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。
   設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。
   根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度*行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
   定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。 引物的穩(wěn)定性依賴(lài)于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個(gè)月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
   Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
   NH4+ K+都會(huì)影響PCR。增加K+的濃度后, 會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當(dāng)然, 過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(KCL>0.2M)時(shí), DNA在94度根本不會(huì)發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無(wú)從談起PCR了.
c. polymerase
   不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真沒(méi)的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
    d. template
    50ul PCR SYSTEM  
human gDNA 0.1ug-1ug
    E.Coli 10ng-100ng
    LamadaDNA 0.5ng-5ng
    Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
   常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開(kāi)始的denaturation
b. annealing
   重點(diǎn)到了。一般情況下, 是從55度開(kāi)始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時(shí)間在30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在annealing temp.時(shí)也會(huì)有一些活性. 所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn).另外,在對(duì)于一些困難戶(hù), 比如從gDNA里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
   原理很簡(jiǎn)單,但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min