酶標(biāo)儀的使用方法

一、測定波長

目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L0時，最大吸收波長移至492nm,同時摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過量時，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此，450nm和492nm兩個波長是目前ELISA測定。
　　
酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長"就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長"則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定外，同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測定，酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長，且不必設(shè)空白孔。

二、測定的吸光度范圍
　　通常，酶標(biāo)儀的吸光度測定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標(biāo)儀可測定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。

三、光學(xué)系統(tǒng)
　　酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個參比通道，每次測定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標(biāo)儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。

四、檢測速度
　　酶標(biāo)儀的檢測速度是指其完成比色測定所需要的時間。檢測速度快，有利于提高檢測的精密度，即避免由于測定過程中，因測定時間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。

五、震板功能
　　酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對ELISA板孔進(jìn)行比色測定前對其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場上常見的酶標(biāo)儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標(biāo)儀上測定即可。

六、溫育功能
　　溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動精確地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育過程可在儀器內(nèi)部完成，而無需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能。

七、軟件功能
　　軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對ELISA定性和定量測定及其他測定方式如酶標(biāo)動力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析并報告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大，則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對于用戶來說，好的軟件功能，對實際工作會有較大的幫助。ELISA定性測定，酶標(biāo)儀如具有陽性判斷值(cut-off)及其測定“灰區(qū)"(即指測定吸光度處于cut-off周圍的一定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑")的統(tǒng)計計算功能，不但方便了實驗室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實用價值。有研究表明，四參數(shù)方程能較好地反映免疫測定的劑量反應(yīng)曲線，最為適合于定量酶免疫測定的曲線擬合。因此，如目的是定量測定，則在酶標(biāo)儀的軟件功能中，最好要有這種曲線回歸方程計算分析功能。其他諸如連點、直線等回歸計算，則可根據(jù)酶標(biāo)儀的應(yīng)用目的而定，如兼用于微量生化測定，則此類回歸計算就很有必要。

八、語言界面
　　通常進(jìn)口的中高檔酶標(biāo)儀人機(jī)對話多采用英文。這對于某些基層實驗室可能會存在語言方面的困難，從而難以最大限度地發(fā)揮酶標(biāo)儀的作用。為解決這方面的問題，已有一些酶標(biāo)儀采用了中文界面。這樣就大大方便了廣大基層實驗室技術(shù)人員的使用。